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繼發性登革熱IgG捕捉法檢測試劑盒

檢(jian)測(ce)程(cheng)序(xu)

注(zhu)： 確(que)保所有(you)試劑(ji)在開始(shi)測定(ding)前平衡至室溫（20-25℃）。在所(suo)給時間和溫度范(fan)圍以外進行(xing)測試(shi)可(ke)能產生無效的(de)結果。不(bu)在預(yu)定時間和溫度范(fan)圍內的(de)測試(shi)必(bi)須進行(xing)重(zhong)復。

ELISA程(cheng)序

• 從(cong)鋁箔(bo)袋中取出所(suo)需(xu)數量的微孔(kong)板并(bing)插(cha)入測試條槽。陰性質控品(pin)(pin)、陽性質控品(pin)(pin)和校準品(pin)(pin)各需(xu)5個微孔(kong)，一式(shi)三(san)份。確保(bao)剩下未使用的微孔(kong)密封于鋁箔(bo)袋內。
• 使用適當的(de)試管或微滴(di)定板稀釋(shi)陽性質(zhi)控品(pin)（P）、陰(yin)性質(zhi)控品(pin)（N）、校準品(pin)（CAL）和患者樣本(ben)。
  • 混合10μL血清(qing)與1000μL樣本稀釋劑。混合均勻。 

或者，

• 混(hun)合10μL血清(qing)(qing)與(yu)90μL樣(yang)本稀(xi)釋(shi)劑(ji)。取出20μL稀(xi)釋(shi)血清(qing)(qing)，加入180μL樣(yang)本稀(xi)釋(shi)劑(ji)。混(hun)合均勻。

• 吸取100 µL樣本稀(xi)釋(shi)劑、質控品(pin)和校(xiao)準品(pin)添(tian)加至對應的微孔中(zhong)。
• 蓋(gai)住測定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘。
• 用稀釋后(hou)的清洗緩沖液洗6次（參考清洗程序）。
• 吸取100 µL HRP標記抗人(ren)IgG添加到每個(ge)微(wei)孔(kong)中。
• 蓋住測定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘。
• 用稀釋后的清洗(xi)緩沖液洗(xi)6次（參(can)考清洗(xi)程序）。
• 吸取100 µL TMB添加(jia)到每個孔(kong)中。
• 在室溫(wen)（20-25℃）下孵育10分鐘，從第①次添加開始計時。藍色將會顯現。
• 按照相(xiang)同(tong)順序吸取100μL終止液添加到每個孔中(zhong)，計時(shi)同(tong)TMB添加步驟。混合均(jun)勻。藍色將變(bian)成黃色。
• 在30分鐘(zhong)內讀取每個孔在450nm波長的吸光(guang)度，參考濾波器(qi)為600-650nm。

注： 如果使用雙波(bo)(bo)長分光(guang)光(guang)度計，將參考濾(lv)波(bo)(bo)器設(she)定(ding)在(zai)600-650nm之間。在(zai)沒有參考濾(lv)波(bo)(bo)器的情況下讀(du)取450nm的微(wei)孔結果可能由于背景原因導致(zhi)吸光(guang)度偏(pian)高。

清洗(xi)程(cheng)序(xu)

為(wei)了清除未(wei)復合(he)的(de)樣本或成分，有效清洗(xi)是ELISA程(cheng)序的(de)關鍵步驟。

A.自動洗板機

• *抽凈所有微孔。
• 在清洗循環期間將每個孔(kong)裝(zhuang)滿(man)至邊緣（350μL）。
• 完成6次清洗(xi)后，將測定板倒立(li)于(yu)吸水(shui)紙巾上用力敲打，確保清除所有清洗(xi)緩沖液。
• 為了確保(bao)有效清洗(xi)，必(bi)須維持自(zi)動洗(xi)板(ban)機良好的(de)(de)保(bao)養。必(bi)須始終遵守廠(chang)商的(de)(de)清潔(jie)說明(ming)。

B.手動(dong)清洗

• 將測(ce)定板的內含物(wu)丟棄到(dao)適當(dang)的廢物(wu)容器。
• 用適(shi)當的擠壓(ya)瓶將微孔填(tian)滿清洗緩沖液(ye)。避免(mian)清洗緩沖液(ye)起泡，否則會(hui)降(jiang)低清洗效(xiao)率。立即丟(diu)棄微孔里的清洗緩沖液(ye)。
• 再(zai)將微(wei)孔填滿清洗緩沖液，并立(li)即丟(diu)棄。
• 重復步驟（3）4次(ci)，共用清(qing)洗(xi)緩沖液清(qing)洗(xi)六（6）次(ci)。
• 后一次清洗(xi)完成后，丟棄微孔的(de)內含物并將測定板置于吸水紙(zhi)巾(jin)上敲打，以確保清除所有(you)清洗(xi)緩(huan)沖液。

質量控制

每(mei)個試(shi)劑盒包含校(xiao)準品(pin)(pin)，陽(yang)性質(zhi)(zhi)(zhi)控(kong)(kong)品(pin)(pin)和(he)(he)(he)陰性質(zhi)(zhi)(zhi)控(kong)(kong)品(pin)(pin)。這(zhe)些組成的可接受值(zhi)參(can)見附帶(dai)的規格表。陰性質(zhi)(zhi)(zhi)控(kong)(kong)品(pin)(pin)和(he)(he)(he)陽(yang)性質(zhi)(zhi)(zhi)控(kong)(kong)品(pin)(pin)用于(yu)監測(ce)重大(da)的試(shi)劑失(shi)敗。陽(yang)性質(zhi)(zhi)(zhi)控(kong)(kong)品(pin)(pin)不能(neng)確保測(ce)定(ding)臨(lin)界值(zhi)的精(jing)密度(du)。如(ru)(ru)果質(zhi)(zhi)(zhi)控(kong)(kong)品(pin)(pin)或(huo)校(xiao)準品(pin)(pin)的任一吸光(guang)度(du)讀數不符合規定(ding)，則測(ce)試(shi)無效(xiao)且應重新(xin)測(ce)試(shi)。如(ru)(ru)果測(ce)試(shi)無效(xiao)，則不能(neng)報告患者結果。必須按照(zhao)地方(fang)、州和(he)(he)(he)/或(huo)聯邦法規或(huo)認證要求以及實驗(yan)室標準QC程序執行質(zhi)(zhi)(zhi)控(kong)(kong)（QC）要求。有關適當的QC操作(zuo)規程指(zhi)南，建議用戶參(can)考CLSI C24-A和(he)(he)(he)42 CFR 493.1256。

預(yu)期值和測(ce)試局限性(xing)

• 必須結合(he)患者的(de)臨床體(ti)征和癥(zheng)狀(zhuang)來做臨床診斷。該(gai)試劑盒的(de)結果(guo)本(ben)身并沒有診斷作(zuo)用(yong)(yong)，應該(gai)與(yu)其他(ta)臨床數(shu)據和患者癥(zheng)狀(zhuang)聯用(yong)(yong)。
• 陽性(xing)(xing)預測(ce)值取決(jue)于(yu)病毒存在的(de)可能性(xing)(xing)。只能檢測(ce)有臨(lin)床癥狀(zhuang)或疑(yi)似接觸過相關病毒的(de)患者。
• 黃(huang)病毒屬內的(de)血清(qing)型交叉反應(ying)（登革熱1、2、3、4，日本腦(nao)炎，西尼羅河病毒，墨累山谷腦炎等）在IgG， 水平上十分常見^3,4,5。在東南亞(ya)進行的(de)試驗(yan)表明(ming)90%的(de)日本腦炎患者（n=20）的(de)IgG間接(jie)結(jie)果大于10 Panbio單位(wei)。
• 利(li)用地方人(ren)群(qun)測定(ding)了臨(lin)界值。 人群血清流行病(bing)學在不同地(di)理區域應(ying)該隨時間而變化。終(zhong)，臨(lin)界值(zhi)需要根據(ju)對(dui)當(dang)地(di)的研究進行調整。
• 尚未確定(ding)目測(ce)結果判(pan)定(ding)的(de)性能特征。
• ELISA篩選試(shi)驗(yan)結果表明登革(ge)熱感(gan)染的所(suo)有血清必須送到參考實驗(yan)室(shi)進行(xing)陽性確認和流行(xing)病(bing)學記錄。

性能(neng)特征

用Panbio Dengue IgG Indirect ELISA對386份經過(guo)血凝抑制試驗（HAI）和ELISA方法的(de)回(hui)顧性(xing)血(xue)(xue)清進(jin)行檢測。這些血(xue)(xue)清包括(kuo)來自(zi)以下組(zu)別的(de)樣(yang)(yang)本(ben)：108份(fen)血(xue)(xue)清陰性(xing)樣(yang)(yang)本(ben)、84份(fen)原發性(xing)樣(yang)(yang)本(ben)、94份(fen)繼發性(xing)樣(yang)(yang)本(ben)和100份(fen)地方性(xing)樣(yang)(yang)本(ben)。 通(tong)過Panbio Dengue IgG Indirect ELISA 對(dui)這些血(xue)清(qing)(qing)樣本進行檢測并將其結果(guo)與血(xue)清(qing)(qing)的登(deng)革熱感染狀態(tai)進行對(dui)比(bi)，從而確定檢(jian)測(ce)的(de)靈敏度、特異性和一致性。數據總(zong)結于(yu)表1。  

馬來西(xi)亞的一(yi)所大(da)學通過(guo)基于世界(jie)衛生組織（WHO）標準的HAI試驗將115份血清樣本確定為原發性(xing)(xing)或繼發性(xing)(xing)登革熱感染。 該試驗組由23份(fen)原發(fa)性(xing)和(he)92份(fen)繼發(fa)性(xing)登革熱(re)樣本構成。

繼發性登革熱IgG捕捉法檢測試劑盒